“文化大革命”期间，各级幼儿教育行政单位被撤销，一些致力于幼儿教育实验的幼儿园遭到批判，不少幼儿园遭受重创，有的被解散，有的师资被下放，无法开展正常的教育教学工作。例如，北京六一幼儿院遭到了严厉的批判；南京市鼓楼幼儿园的教师被下放，有的举家到农村务农，有的转行到商店当营业员，还有的到煤店打煤饼。幼儿园的教育实验基本停止。
幼儿园园长被视为“走资本主义道路的当权派”而遭受了批斗，如北京师范大学实验幼儿园园长周南就是被批斗的园长之一，搞幼儿教育实验是她的一大罪状。一些园内优秀教师也遭到了人身攻击。一些幼儿园取消了岗位和分工，因为幼儿园教师和保育员进行合理分工的做法也受到了批判。幼儿园取消了规章制度，勤杂工、保育员、教养员、园长轮流换班，这使幼儿园陷于混乱局面，幼儿园失去了有效领导和管理。
一些幼儿园的园舍、场地被挤占，作为幼儿伙伴和学习材料的玩具、教具与幼儿读物被销毁或禁止，不少幼儿园被迫解散。“文化大革命”期间，南京市的幼儿园被削减掉1/3,吉林省和龙县有90%以上的幼儿园被解散。直至20世纪70年代初，各地幼儿园才逐渐恢复，但增长速度较缓慢。1973年，全国幼儿园数约为4.6万所，是1965年的2.4倍；1975年，全国有幼儿园约17.2万所，是1973年的3.7倍；1976年约为44.3万所，比1975年增加了约1.6倍，此时在园幼儿数增加到近14万人。